紫外交聯(lián)儀在麥角硫因研究中的創(chuàng)新應(yīng)用

01實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

　　麥角硫因(ergothioneine，EGT)作為一種天然手性氨基酸衍生物，存在硫醇和硫酮兩種互變異構(gòu)形式。研究表明EGT可抑制脂質(zhì)過氧化損傷，清除羥自由基(·OH)、超氧化物和單線態(tài)氧(1O2)等多種活性氧(ROS)物質(zhì)，是優(yōu)異的皮膚光敏保護(hù)劑。通過紫外線照射光敏劑羅丹明B(RhB)溶液誘發(fā)包括1O2在內(nèi)的自由基體系(簡(jiǎn)稱UV-RhB體系)，模擬紫外線照射人體皮膚產(chǎn)生ROS的情況，研究EGT在此體系下的抗氧化性能及其穩(wěn)定性，以期為EGT應(yīng)用于抗衰護(hù)膚品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

02實(shí)驗(yàn)方法

1. UV-RhB體系中EGT和VC抗氧化性能的測(cè)定

　　以pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS，取2.2 g Na2HPO4，0.3 g NaH2PO4和8.5 g NaCl，加水溶解至1000 ml)為溶劑，分別配制0.001 %羅丹明B溶液(RhB)、0~1.00 mg/ml的EGT溶液及維生素C(VC)溶液。按表1配制測(cè)定溶液體系I、II，置紫外光(波長(zhǎng)254 nm，光強(qiáng)度5 mW/cm2)下照射。分別于0，1 h時(shí)，采用酶標(biāo)儀，測(cè)定555 nm波長(zhǎng)處吸收值(A0和A1)，每個(gè)樣品平行3份，計(jì)算0 h和1 h吸光度變化量的平均值(ΔA)，以ΔA空白為基線，按下式計(jì)算體系中活性物質(zhì)的抗氧化性能(F)。F(%)= (ΔA空白-ΔA樣品)/ ΔA空白×100 ΔA空白式中，ΔA空白：空白對(duì)照溶液的吸收值的變化量(A0空白-A1空白);ΔA樣品：樣品溶液的吸收值的變化量(A0樣品-A1樣品)。

2.離子強(qiáng)度對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　按表1配制測(cè)定溶液體系III，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，以EGT濃度為0的體系作為空白對(duì)照，分別加入NaCl濃度分別為0 %，0.40 %，0.85 %，1.30 %，1.75 %的PBS。按2.1項(xiàng)下方法平行測(cè)定3份，取其平均值，計(jì)算不同離子強(qiáng)度體系的ΔA和F值。

3.pH值對(duì)EGT抗氧化性能的影響?????

　　按表1配制測(cè)定溶液體系IV，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，以EGT濃度為0的體系作為空白對(duì)照，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)PBS緩沖液pH值為3.0，5.0，7.2，9.0，11.0。按1項(xiàng)下方法平行測(cè)定3份，取其平均值，計(jì)算不同pH體系的ΔA和F值。

4.還原劑對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　按表1配制測(cè)定溶液體系V，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對(duì)照，Na2SO3溶液以PBS緩沖液為溶劑，濃度分別為0 %，0.02 %，0.05 %，0.10 %，0.25 %，0.50 %。按1項(xiàng)下方法平行測(cè)定3份，取其平均值，計(jì)算不同還原劑濃度體系的ΔA和F值。

5.金屬離子對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　按表1配制測(cè)定溶液體系VI，其中溶劑為生理鹽水，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對(duì)照。分別加入0.05 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+生理鹽水溶液。按1項(xiàng)下方法平行測(cè)定3份，取其平均值，計(jì)算不同金屬離子體系的ΔA和F值。

6.EDTA對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　按表1配制測(cè)定溶液體系VII，其中溶劑為生理鹽水，EGT溶液濃度為0.25 mg/ml，并以EGT濃度為0的體系作為空白對(duì)照。分別加入0.10 mol/L的Fe3+溶液和0 %，0.02 %，0.04 %，0.10 %，0.20 %的EDTA溶液。按1項(xiàng)下方法平行測(cè)定3份，取其平均值，計(jì)算不同EDTA濃度體系的ΔA和F值。

03實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.EGT和VC的抗氧化量效關(guān)系

　　不同濃度EGT和VC的抗氧化性能見圖1。由圖1可見，0~1 mg/ml范圍內(nèi)，EGT和VC的F值隨濃度的升高而增大，且相同濃度下EGT的F值一直高于VC，表明EGT和VC抗氧化作用具有較好的量效關(guān)系，同時(shí)在此體系下EGT的抗氧化性能優(yōu)于VC。

2.離子強(qiáng)度對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　離子強(qiáng)度對(duì)EGT抗氧化性能的影響見圖2。由圖2可見，NaCl濃度在0 %~0.85 %范圍內(nèi)，EGT的F值較為穩(wěn)定，當(dāng)NaCl濃度高于0.85 %時(shí)，F(xiàn)值急劇下降，表明此時(shí)EGT抗氧化性能受到體系內(nèi)高離子強(qiáng)度的抑制而顯著降低。

3.pH值對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　pH值對(duì)EGT抗氧化性能的影響見圖3。由圖3可見，在pH 5~9范圍內(nèi)EGT的F值變化相對(duì)較小，表明EGT抗氧化活性在pH 5~9范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。

4.還原劑對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　還原劑亞硫酸鈉對(duì)EGT抗氧化性能的影響見圖4。由圖4可見，隨著亞硫酸鈉濃度的增大，F(xiàn)值呈下降趨勢(shì)，表明在此體系中加入亞硫酸鈉可抑制EGT的抗氧化活性。亞硫酸鈉濃度大于0.1 %時(shí)，F(xiàn)值趨于穩(wěn)定，表明其抑制作用趨于平緩。

5.金屬離子對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　不同金屬離子對(duì)UV-RhB體系的影響見圖5A。結(jié)果顯示，與Na+體系相比，K+、Mg2+、Zn2+體系中ΔA空白變化較小，表明加入這3種離子對(duì)體系內(nèi)RhB的降解速率影響較小;Cu2+對(duì)RhB的降解速率有較明顯的抑制，而加入Fe3+后，體系中RhB降解速率顯著提高，分析原因?yàn)镕e3+在水中形成Fe(OH)2+，經(jīng)光照射生成Fe2+和羥自由基，增大了體系內(nèi)自由基的濃度，進(jìn)一步加劇了RhB的降解。

　　不同金屬離子對(duì)EGT抗氧化性能的影響見圖5B。結(jié)果顯示，與Na+體系相比，Zn2+對(duì)EGT抗氧化性能沒有明顯影響，K+、Mg2+對(duì)EGT的抗氧化作用有一定程度的抑制，Cu2+在抑制RhB降解的同時(shí)對(duì)EGT的抗氧化性能也有較為明顯的抑制作用。而在體系中加入Fe3+，RhB降解速率提高的同時(shí)，EGT的抗氧化性能也得到了明顯的提升，這也表明EGT可有效抑制Fe3+誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

6.EDTA對(duì)EGT抗氧化性能的影響

　　EDTA對(duì)EGT抗氧化性能的影響見圖6。由圖6可見，在添加Fe3+的體系中，EGT抗氧化性能隨EDTA的濃度增加而減小，分析原因?yàn)镋DTA與Fe3+形成金屬絡(luò)合物后降低了體系內(nèi)Fe3+的濃度，削弱了Fe3+對(duì)UV-RhB體系和EGT抗氧化性能的影響。

04實(shí)驗(yàn)結(jié)論

　　本文通過建立紫外輻射光敏劑誘發(fā)自由基體系，測(cè)定抗氧化活性物質(zhì)的抗氧化性能。在此體系下EGT表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性能，且在低離子強(qiáng)度和pH 5~9范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。